Nel 1347 Carlo IV viene incoronato a Re di Boemia, in successione al padre e decide di portare aventi il suo progetto di riqualificazione della sua città natale.

Nel 1348 hanno quindi inizio i primi centri studi universitari a Praga, coinvolgendo intellettuali da tutta Europa. In questo modo la capitale boema divenne un centro culturale importante al pari delle altre città reali.

Durante la riforma di Jan Hus, gli studenti tedeschi vennero espulsi dall'università inasprendo le tensioni tra la Boemia e il resto del Sacro Romano Impero.

Oggi l'università Karlova continua a portare avanti la sua tradizione, anche se le varie sedi delle difese facoltà che la compongono sono ubicate in vari palazzi o campus nelle varie zone di Praga